جستجوی M.O های بی هوازی در خاک(کلستریدیوم ها)

جستجوی M.O های بی هوازی در خاک(کلستریدیوم ها)

مقدمه:

 

1. کلستریدیوم ها:

 

باسیل گرم مثبت درشت اسپوردار بي هوازي اجباري مي باشند . اسپور دراين جنس معمولا انتهايي يانزديك به انتها مي باشد . اغلب متحرك ئداراي فلاژل ازنوع پري تريش مي باشند . تستهاي كاتالاز واكسيداز منفي مي باشد .
كلستريديوم بوتولينوم C.botulinum
عامل بوتوليسم (مسموميت غذايي شديد وكشنده ) باسيل درشتي است كه اسپور آن بيضي شكل ونزديك به انتها قرار دارد . اين باكتري بي هوازي مطلق ومتحرك است .
براي جداسازي باكتريهاي كه اسپوردارند ازروش جداسازي به كمك حرارت استفاده كرد . براي اين منظور بايد نمونه مورد ازمايش رادرسرم فيزيولوژي سوسپانسيون شده وبه مدت 10 دقيقه جوشانده شود تاساير باكتريهاي بدون اسپور ازبين برود ( شوك حرارتي) سپس نمونه رادرشرايط مناسب (بي هوازي براي كلستريديومها) كشت داده وكلنيهاي ارگانيسم راشناسايي كنيد .
از محيطهاي انتخابي EYA (Egg-Yolk agar) و( CBI ( C.botulinum Isolation براي ايزوله كردن كلستريديومبوتولينوم استفاده مي شود .
نكته : براي شناسايي توكسين بوتوليسم ازتست الايزا وراديوايمونواسي وهماگلوتيناسيون پاسيو استفاده كرد .
كلسترديوم تتاني : C. tetani
كلسترديوم تتاني ياباسيل نيكولاير عامل بيماري كزاز مي باشد . اين باكتري بي هوازي اجباري است وداراي اسپورانتهايي بزرگي است كه ظاهري شبيه چوب طبل براي باكتري ايجاد مي كند . اين باكتري متحرك وفلاژل آن ازنوع پري تريش مي باشد . قند هاراتخمير نمي كند وكاتالاز منفي است .
تشخيص آزمايشگاهي :
1- كشت : از محيط تيو گليكولات غني شده ، (Cooked Meat Broth ) CMB و آگار خوندار مي توان جهت كشت استفاده كرد . براي كشت پليت ها بايد به مدت 48 ساعت درشرايط بي هوازي ( ./.80 درصد نيتروژن ، 10درصد گازكربونيك .10 درصد هيدروژن ) در37 درجه سانتيگراد قرار گيرد.
كلستريديوم تتاني درسطح آگار خوندار ايجاد هموليز وسوارمينگ مي كند .
2- تست آگلوتيناسيون : كلني خالص ارگانيسم مورد نظر راباآنتي سرم پلي والان كلستريديوم تتاني مجاور مي كنيم كه درصورت توليد آگلوتيناسيون حضو ركلستريديوم تتاني اثبات مي شود .
كلستريديوم پرفرنژنس C. perfringens :
پرفرنژنس يا باسيل ولشاي عامل اصلي بيماري گانگرن گازي است . اين باكتري بدون حركت وداراي يك اسپور بيضي شكل مركزي يانزديك به انتهاست . وباعث تورم سلول نمي شود . تاكنون 6 گروه آنتي ژني ازكلستريديوم شناسايي شده كه باحروف A تاF نامگذاري شده كه گروهA وگاهي F براي انسان بيماريزايند اسپور اين باكتري در موادغذايي كه حرارت كافي به قسمتهاي مياني ودروني آن نمي رسد وپس پخته شدن مدتي گرم نگهداري مي شوند باقي مانده وچنانچه شرايط وزمان رشد مناسب باشد مي تواند باعث مسموميت شود .
تشخيص آزمايشگاهي :
1_ بررسي ميكروسكوپي : پس ازرنگ آميزي گرم باسيل درشت گرم مثبت بادوانتهاي گرد ، شبيه واگن قطار وبه صورت موازي مشاهده مي شود داراي يك اسپور بيضي شكل انتهايي يا نزديك به انتهاست .
2_ كشت : نمونه رادرآگار خوندار ، تيوگليكولات مي توان كشت داد . پس از 24 ساعت در شرايط هوازي مي توان بررسي كرد كه ’ا برروي آگار خوندار ايجاد هموليز دوگانه مي كند . هموليز بتا درداخل وهموليز آلفا درخارج ايجاد مي گردد . (از محيطهاي كشت اختصاصي نظير Lowbury و Lilly مي توان استفاده كرد .
نكته : كلستريديوم پرفرنژنس درمجاورت هوا زنده مي ماند ومي تواند رشد كند .
تستهاي تشخيصي :
1_ آزمون بررسي ترشح لسيتيناز :
ليسيتيناز باكتري قادر است كه لستين ( ماده طبيعي درزرده تخم مرغ ) رابه دي كيليسريدهاي نامحلول تبديل كند كه منجر به توليد هاله اي سفيد رنگ تامات دراطراف كلني درمحيط كشت حاوي لسيتين مي شود .
روش كار : يك كلني خالص رابرروي محيط كشت آگار زرده تخم مرغ (Egg Yolk Medium) منتقل كنيد سپس پليت رابه مدت 24 تا48 ساعت دردماي 36 درجه سانتيگراد قرار دهيد بعد از اين مدت پليت ها راازنظر كلنيهاي باهاله اي ازرسوب سفيد رنگ بررسي مي شود .
2_ تست نگلر (ممانعت از آلفا لسيتنيناز):
روش كار : ازپليت آگار خوندار با10 درصد زرده تخم مرغ (EYA) استفاده مي شود .به وسيله سواب كلني رادرسطح پليت كشت داده نيمي از سطح محيط كشت راباآنتي توكسين آلفا لسيتيناز بپوشانيد ودردماي 37 درجه سانتيگراد به مدت 24تا 48 ساعت نگهداري كنيد . درنيمه فاقد ضد سم اطراف پرگنه ها هاله كدري مشاهده مي شود ولي در نيمه ديگر هاله موجود نيست كه به علت آنتي توكسين مي باشد .
نكته : تست لسيتيناز دركلستريديوم باراتي ، كلستريديوم بايفر منتاس و كلستريديوم سوردلي نيز مثبت است به همين دليل تست لسيتيناز نمي تواند به تنهايي تائيد كننده قطعي پرفرنژنس باشد وبايد براي تشخيص قطعي ترشح الفا لسيتيناز توسط تست نگلر يررسي شود .
3_ تخمير طوفاني شير : stormy clot
روش كار : مقداري از كلني پرفرنژنس رادرلوله آزمايش حاوي شير تلقيح كرده وسپس به مدت 24 ساعت دردماي 37 درجه سانتيگراد درشرايط بي هواز ي قرار دهيد (ريختن پارافين روي لوله) .شير همراه باتوليد گازوتغيير شكلي بانماي طوفاني منعقد مي شود .
4_  تخمير قندها :مقداري از كلني رادر لوله هاي محتوي محيط پايه فنل رد كه به طور جداگانه 1 درصد ازقندهاي گلوكز، ساكاروز، سالي سين، لاكتوز، مانيتول ومالتوز مي باشند بيفزاييد ، سپس آنها رابه مدت24 ساعت درجار بي هوازي در37 درجه قرار دهيد .
مالتوز +
مانيتول -
سالي سين متغيير
لاكتوز +
ساكاروز +
گلوكز +

نكته : كلستريديوم پرفرنژنس داراي Reverse Camp مثبت است ودرشرايط آزمايشگاهي اسپور توليد نمي كند .
نكته : درتست نگلر آنتي توكسين TYPA پرفرنژنس مورد استفاده قرار مي گيرد .
نكته : سميت توكسين بوتولينوم دربين كلستريديوم تتاني ، كورينه باكتريوم ديفتريه ويرسينيا پستيس از همه قوي تر است .
روش آزمايشگاهي درمواد غذايي : 10گرم ازماده غذايي مشكوك راتوزين كرده وسپس 10 ميلي ليتر محلول بافر فسفات به آن بيفزاييد ودر هاون چيني سترون كاملا يكنواخت كنيد . انگاه دوبطري درپيچ دار محتوي محيط گوشت پخته را انتخاب وآنها رابه مدت 5 دقيقه بادرشل جهت تخليه حبابهاي اكسيژن درحمام آب 80 درجه سانتيگراد قرار دهيد وبعد از خارج كردن ازحمام وكمي سرد شدنبه هريك ازلوله ها 2 الي 3 ميلي ليتراز سوسپانسيون آماده شده نمونه غذايي بيفزاييد ويكي ازدولوله راعلامت گذاري كنيدولوله علامت گذاري شده رابه مدت 10 دقيقه در65 درجه سانتيگراد قرار دهيد سپس2 تا4 ميلي ليتر ازمخلوط وازپار سترون (مخلوط مساوي از وازلين وپارافين )راكه ذوب شده به آهستگي ازكنارلوله طوري بريزيد كه سطح محيط راكاملا فرابگيرد وبعد هردولوله رابه مدت 48 ساعت درگرمخانه 37 درجه سانتيگراد قراردادهوس1س لوله هارابررسي كنيد. درصورت رشد باكتري بخش مايع داخل لوله كدر مي شود .
شمارش درمحيط آگارخوندار بانئومايسين

3 پتري ديش محتوي آگار خوندار انتخاب وبه سطح هريك از آنها مقدار 1/. ميلي ليتر ازمحلول يك درصد نئومايسين رابيفزاييد . پس ازخشك شدن سطح محيط به هريك از آنها يك دهم ميلي ليتر از رقتهاي موردنظر افزوده وتوسط ميله شيشه اي پخش كنيد . سپس دوظرف پتري رادرجار بي هوازي به مدت 48 ساعت در37 درجه سانتيگراد قرار دهيد پليت سوم رابه عنوان شاهد دردماي 37 درجه وشرايط هوازي قرار دهيد . سپس پليت ها راخارج كرده پرگنه ها راشمارش كرده وميانگين تعداد پرگنهايي كه دردو پليت ودر شرايط بي هوازي رشد كرده اند بدست آورده ، سپس تعداد پرگنهايي راكه روي پليت شاهد در شرايط هوازي رشد كرده اند از آن كم كنيد . تعداد رادر رقت مورد آزمايش ضرب كرده وبر حسب گرم ماده غذايي گزارش كنيد .

 

2. میحط های کشت مورد استفاده:

Cooked meat media       تیوگلیکولات براث

blood agar

Cooked meat media :

از این محیط برای کشت به دلیل وجود پارافین بر روی محیط کشت باعث رشد  باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیط مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی منجمله کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته، و هدف این است که محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی ایجاد نمود.بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.

تیوگلیکولات براث :

 

اين آبگوشت غني كننده به طور معمول در آزمايشگاههاي ميكروبشناسي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. مقدار آگار موجود در محيط تيوگليكولات 075/0 درصد بوده و اين مقدار آگار جهت جلوگيري از ورود جريان اتمسفر حاوي اكسيژن به داخل آبگوشت استفاده شده است. تيوگليكوليك اسيد به عنوان يك عامل احياء كننده جهت پايين آوردن پتانسيل اكسيداسيون احياء در محيط استفاده شده است. با اضافه نمودن تعداد زيادي از فاكتورهاي مغذي مانند كازئين – عصاره مخمر، گوشت، و ويتامين‌ها و غيره به اين محيط، رشد اكثر باكتريهاي پاتوژن تشديد مي‌گردد. ساير مكمل‌هاي غذايي، انديكاتور اكسيداسيون-احياء (Resazorin)، دكستروز، ويتامين K₁ و هِمين (hemin) در فرمولهاي تغيير يافته ديگر به محيط اضافه شده است. تكنولوژيست‌ها در اين محيط مي‌توانند تفاوت بين انتشار باكتريها در محيط را مشاهده نمايند. باسيل‌هاي گرم-منفي اختياري در سراسري محيط پخش مي‌شوند، كوكسي‌هاي گرم – مثبت به صورت توپ باد كرده (puff ball) رشد مي‌كنند و هوازيهاي مطلق مانند سودوموناس و مخمرها به صورت يك لايه نازك در سطح آگار رشد مي‌نمايند. جهت رشد باكتريهاي بيهوازي اگر به محيط تيوگليكولات مكمل هِمين (hemin) به مقدار 5 ميكروگرم در ميلي ليتر و ويتامين K₁ به ميزان 1/0 ميكروگرم در ميلي ليتر و بيكربنات سديم به ميزان 1 ميلي گرم در ميلي ليتر اضافه گردد نتايج بهتري حاصل مي‌گردد.  

 

blood agar :

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتریهای بیماریزا بخصوص باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود.بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتریها را نیز می توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه هنگامی که درجه آن تا حدود 50 درجه سانتیگرا د رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل می ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد.

1-همولیز کاملβ:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده واطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد.                                                        

 

2- همولیز ناقصα:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از 50 درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

 

 3-عدم همولیزγ :باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

 

تئوری آزمایش:

 

کلستریدیوم ها میله ای و گرم منفی،بی هوازیند و منشا خاکی دارند . با تخمیر قند CO2 و H2 بوتریک اسید تولید می کنند.اهمیتشان از این جهت است که تولید توکسینی به نام نوروتوکسین می کنند که با جذب از روده بر روی اعصاب تاثیر می گذارد و عضلات غیر ارادی بدن را منقبض می سازد.

با توجه به بی هوازی بودن کلستریدیوم باید بایتسی با ایجاد شرایطی میزان اکسیژن موجود در محیط را به حداقل رسانیم و شرایط خلا را ایجاد کنیم.لذا از روش های Anaerobic jar و candle jar استفاده  می کنیم.

اشرشياكلي

                                       

---

 

باكتري اشرشيا كلي (E.coli) به صورت عادي در دستگاه گوارش انسان زندگي مي كند و معمولا بيماري  زا نيست، ولي سويه هاي خاصي از اين باكتري تحت شرايط خاص مي توانند بيماري هاي مختلفي ايجاد كنند.

 

 

اين بيماري ها در دو دسته عفونت هاي روده اي و غير روده اي قرار دارند. بيشتر موارد آلودگي به عفونت هاي غيرروده اي و به خصوص عفونت هاي ادراري در سالمندان ديده شده است. ميزان آلودگي به اين باكتري در دهه گذشته دو برابر شده است و ساليانه بيش از 17 هزار مورد ابتلا به اين باكتري در بيمارستان ها گزارش مي شود. عفونت هاي گوارشي ناشي از اين باكتري بسته به سويه خاص باكتري به صورت اسهال ساده تا اسهال همراه با خون است و با تأمين آب و الكتروليت هاي مورد نياز بدن درمان مي شود و نيازي به مصرف آنتي بيوتيك نيست.

 انواع اشرشياكلي بيماري زا‌:

اشرشياكلي انتروپاتوژنيك (EPEC) :‌ عامل اسهال حاد آبكي به ويژه در كودكان است كه بسيار به اين ميكروب حساس هستند. مخزن بيماري انسان بوده و افراديكه با امر غذا سر و كار دارند و همچنين فاضلاب مي تواند به عنوان منبع آلودگي عمل نمايند .

 

     

 

اشرشياكلي انترواينويسيو (EIEC) :‌ عامل سندرم ديسانتري (التهاب روده بزرگ همراه با دفع مدفوع آبكي يا خوان آود ) مي باشد. مخزن اين بيماري هم انسان بوده و افراديكه با امر غذا سر و كار دارند و همچنين فاضلاب مي تواند به عنوان منبع آلودگي عمل نمايند .

اشرشياكلي انتروتوكسيژنيك (ETEC) : عامل اسهال حاد آبكي معمولا در مسافران مي باشد. در اين بيماري نيز انسان به عنوان مخزن و افراديكه با امر غذا سر و كار دارند و همچنين فاضلاب مي تواند به عنوان منبع آلودگي عمل نمايند .

اشرشياكلي انتروهموراژيك (EHEC) :‌ سندرم اسهال خوني را در بيماران باعث مي شود. مخزن بيماري گوساله و مدفوع گوساله، جابجايي گوشت، ابزار و وسايل و لبنيات مي تواند در انتقال بيماري نقش منبع آلوده كننده را ايفاء نمايد.  شير غير پاستوريزه ، پخت ناكافي گوشت ( مثل همبرگرها) هم مي تواند يكي از دلايل شيوع اين بيماري باشد.

E.Coli از ارگانيسم هاي آشنا و شناخته شده براي باكتري شناسان  است كه به طور طبيعي در روده حيوانات خون گرم، انسان و پرندگان وجود دارد. اگرچه E.Coli به طورطبيعي در روده همه انسان ها وجود دارد ولي بدن ما قادر به پذيرش منابع خارجي آن نيست.

اسهال ناشي از اين ميكروارگانيسم احتمالا يكي از شايعترين علل در كودكان است. علائم و عوارض ايجاد شده توسط انواع گوناگون ارگانيسم بر حسب شدت متفاوت است. هنگامي كه مسافران با فلور ميكروبي كشورهاي مختلف خود را تطبيق مي دهند، اغلب شكل ملايمي از اسهال را تجربه مي كنند.

 

به طور كلي اشرشيا كلي،  علت شايع مسموميت غذايي است. برخي از گونه هاي آن به طور طيبعي در روده حيوانات و انسان يافت مي شود. حدود صدها گونه از اشرشيا كلي وجود دارد كه بيشتر آنها مضر هستند.اين باكتري ها از طريق دست هاي آلوده به مدفوع، گوشت خام، شير و آبميوه غير پاستوريزه منتقل مي شود. كالباس، سوسيس و كاهو نيز اين باكتري را منتقل مي كنند. پس از ورود اين باكتري از طريق دهان، اين باكتري وارد روده ها مي شود و به سلول هاي مخاط روده مي چسبد و شروع به تكثير ميكند و هنگامي كه تعداد آنها زياد شود، همگي شروع به آزاد كردن سم مي كنند. سم ناشي از باكتري ها، مخاط روده را تخريب و دردهاي شديد شكمي و اسهال را ايجاد مي كند.

دوره كمون :‌  بسته به نوع اشرشياكلي  24- 8 ساعت است.

علائم بيماري : مدفوع شل و آبكي، حالت تهوع، استفراغ، فوريت براي رفتن به توالت، تب، سردرد، دفع دردناك و مدفوع خوني از علائم شايع اين بيماري هستند.

انتقال بيماري از طريق ( انسان ـ موادغذايي ـ انسان ) مي باشد. حداقل دز بيماري زايي 10¹⁰-10⁸ در هر گرم ماده غذايي است . ميزان مرگ و مير در نوزادان بالا مي باشد . عامل بيماري اسهال مسافران بوده و اين بيماري در نقاطي شايع مي باشد كه بهداشت رعايت  نمي شود. معمولا اسهال مسافران به سرعت ايجاد نمي شود و ممكن است 2 تا 3 روز بعد از خوردن يا هنگام بازگشت به منزل ايجاد گردد.

 

مواد غذايي در معرض خطر : گوشت ـ ماهي ـ شير ـ آب آلوده در معرض خط آلودگي به اين باكتري هستند و مهمترين منبع آلودگي ، سبزي هاي خام و سالاد مي باشد .

  

 

پيشگيري : كنترل بهداشت كارگران آشپزخانه ، كنترل آب مصرفي . عدم مصرف سالاد و سبزي خام در رستورانها به ويژه غذاخوري هاي بين راهي و شستن دست ها يكي از عوامل عمده پيشكيري از انتقال بيماري است.

درمان : در موارد خفيف بدون مراجعه به پزشك نيز مي توان اين بيماري را كنترل كرد. با مصرف روزانه 2 تا 5/3 ليتر مايعات، حجم آب از دست رفته را مي توان جبران كرد. در 24 ساعت اول بهتر است از آب ميوه هاي پاستوريزه، مايعات بدون كافئين ، چاي داغ و آب گوشت يا مرغ استفاده كنيد. در 24 ساعت دوم غذاهاي ملايم ونرم مثل برنج، نان و غلات مصرف نماييد.

 روش هاي انتقال : تماس مستقيم هنگام خرد كردن گوشت ، ماهي و گوشت خام و غذاهاي گوشتي نيمه پخته ، استفاده از آبليمو و فرآورده هاي لبني  غير پاستوريزه ، خوردن سبزيجات خام بدون ضدعفوني كردن ، استفاده از اب آلوده و يخ هاي سر راه ( عرضه غير بهداشتي ) و استفاده از غذاي دوره گرد هاي خياباني همگي مي توانند در انتقال بيماري نقش موثري داشته باشند .

 

نام و نام خانوادگی :
ایمیل شما :
موضوع :
نظر شما در مورد این مطلب :