Prokaryotic Cell Structure

Bacterial Cell Structure

Mariana Ruiz Villarreal/Wikimedia Commons

Prokaryotes are single-celled organisms that are the earliest and most primitive forms of life on earth. As organized in the Three Domain System, prokaryotes include bacteria and archaeans. Prokaryotes are able to live and thrive in various types of environments including extreme habitats such as hydrothermal vents, hot springs, swamps, wetlands, and the guts of animals.

Prokaryotic Cell Structure

Prokaryotic cells are not as complex as eukaryotic cells. They have no true nucleus as the DNA is not contained within a membrane or separated from the rest of the cell, but is coiled up in a region of the cytoplasm called the nucleoid. Using bacteria as our sample prokaryote, the following structures can be found in bacterial cells:

• Capsule - Found in some bacterial cells, this additional outer covering protects the cell when it is engulfed by other organisms, assists in retaining moisture, and helps the cell adhere to surfaces and nutrients.


• Cell Wall - Outer covering of most cells that protects the bacterial cell and gives it shape.


• Cytoplasm - A gel-like substance composed mainly of water that also contains enzymes, salts, cell components, and various organic molecules.


• Cell Membrane or Plasma Membrane - Surrounds the cell's cytoplasm and regulates the flow of substances in and out of the cell.


• Pili - Hair-like structures on the surface of the cell that attach to other bacterial cells. Shorter pili called fimbriae help bacteria attach to surfaces.


• Flagella - Long, whip-like protrusion that aids in cellular locomotion.


• Ribosomes - Cell structures responsible for protein production.


• Plasmids - Gene carrying, circular DNA structures that are not involved in reproduction.


• Nucleiod Region - Area of the cytoplasm that contains the single bacterial DNA molecule

Binary Fission

E. coli bacteria undergoing binary fission. The cell wall is dividing resulting in the formation of two cells.

Janice Carr/CDC

Most prokaryotes reproduce asexually through a process called binary fission. During binary fission, the single DNA molecule replicates and the original cell is divided into two identical cells.

• Binary fission begins with the single DNA molecule replicating and both copies attaching to the cell membrane.
  
  
• Next, the cell membrane begins to grow between the two DNA molecules. Once the bacterium just about doubles its original size, the cell membrane begins to pinch inward.
  
  
• A cell wall then forms between the two DNA molecules dividing the original cell into two identical daughter cells.

PCRخیلی کلی(خواهشم جهت استفاده نام منبع سایت ذکر شود.ممنون)

IN THE NAME OF GOD

     PCR (the polymeras chain reaction)     

اين تكنيك در اواسط دهه 1980 به وسيله كری ‌مو ليس Kary mullis‌ معرفی‌شد. PCR روشی ‌برای ‌تكثير يك توالی خاص در DNA ‌است. ديگر لازم نيست برای ‌به دست آوردن نسخه های‌ متعدد از يك ژن خاص، آن را وارد حامل مناسب كرده و در يك باكتری‌، تكثير كنند و امروزه اين كار به سادگی و با استفاده از PCR ‌ انجام می پذيرد. يعنی ‌ PCR‌هم چون ايجاد كلونی در مهندسی ژنتيك نوعی ازدياد مولكولی‌است كه در اثر آن تعداد زيادی‌ نسخه از منطقه ای ‌خاص از DNA هدف حاصل می‌شود. PCR از نظر اصول علمی‌تشابه زيادی ‌به همانند سازی‌ DNA ‌دارد؛ در واقع بر گرفته از آن است. با حرارت دادن می توان دو رشته DNA را از هم جدا كرد و با سرد  كردن مي توان دوباره دو رشته DNA را با هم جفت كرد. از اين ويژگي DNA در تكنيك ‌ PCR استفاده مي شود. بعلاوه براي انجام ‌ PCR به DNA پليمراز، نوكلئوتيد تري فسفات ها و پرايمر نياز است. اما از آنجايي كه DNA دو رشته اي است، دو نوع پرايمر در PCR ‌ مورد نياز است.3مرحله  این تکنیک شامل:

مرحله دناتوراسيون DNA: ‌در مرحله اول براي مدت كوتاهي (30 ثانيه) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتيگراد حرارت مي‌دهند تا دو زنجيره DNA از هم باز شود.

مرحله پرايمر و مرحله اتصال دو قطعه نوكلئوتيدي: ‌اين قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلي تشكيل مي‌شوند و مي‌توانند به قطعات مكمل خود كه بر روي ژن مورد نظر قرار مي‌گيرند، اتصال يابند. قطعه‌اي كه در آن PCR به تعداد زياد ساخته مي‌شود مرحله اتصال پرايمرها كوتاه بوده و  در حدود 30 ثانيه در دماي 65 - 30 درجه سانتيگراد صورت مي‌گيرد.

مرحله پليمريزاسيون يا مرحله سنتز: ‌در اين مـرحلـه، با دخالت آنزيم DNA پليمراز بر روي رشـتــه DNA الـگــو و سـنـتــز DNA بــا اسـتـفـاده از نـوكـلـئـوتـيـد تـري فـسـفـات‌هـايي كه در محلول وجود دارند، صورت مي‌گيرد و براي سنتز DNA هـميشه يك رشته DNA به صورت الگو و يك قطعه پلي نوكلئوتيدي به عنوان پرايمر مورد نياز است. 

ادامه PCR بعد از چرخه اول 
بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام مي‌شود و چـرخـه ‌هاي بعدي تكرار چرخه اول است. بدين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي افزايش مي‌يابد. يعني از 20 چرخه ، ژن مورد نظر داراي بـــيــــــش از 1مـــيـــلـــيـــــون خـــــواهـــــد بـــــود . بنابراين روش PCR روشي كارا در ازدياد يك قطعه از DNA است. 

مهمترین کاربردهای pcr: 1(مهندسی ژنتیک   2)بیولوژی مولکولی   3)میکروب شناسی تشخیصی

4)تشخیص سرطانها وجهشها     5)بیماریهای ژنتیکی         6)تشخیص هویت           7)جرم شناسی

8)تعیین ترادف       9)باستان شناسی           10)مطالعه تکاملی موجودات         11)تعیین جنسیت

12)تهیه نسخه های متعدد از یک ژن               13)برسی حضورر یا عدم حضور یک ژن در  DNA

13)پیوستگی ژنها وکراسینگ اوور               14)بیوتکنولوژی                       15)تعیین جنسیت

كاربردهاي مهم pcr:

‌تهيـه نسخه‌هاي متعدد از يك ژن مورد نظـر: ‌گاهي براي مطالعات بيولوژي مولكولي لازم است كه يك ژن با نسخه‌هاي نسبتا زياد در دسترس باشد. بدين منظور مي‌توان با استفاده از روش PCR،‌ ژن مورد نظر را در مقايسه با بقيه ژن‌ها تكثير كرد.

‌بررسي حضور يا عدم حضور يك ژن: ‌با استفاده از اين روش مي‌توان تشخيص داد كه آيا يك ژن در يك سلول حضور دارد يا نه؟ گاهي نيز از اين مطالعات براي بررسي وجود ژن‌هاي مختلف باكتري‌ها يا ويروس‌ها در بدن افراد استفاده مي‌كنند.

‌تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد: با استفاده از PCR و به كار گرفتن پرايمرهاي مربوط به يك ژن بيمار و پرايمرهاي مربوط به ژن سالم آن، مي‌توان از تولد كودكان داراي بيماري‌هاي ژنتيكي جلوگيري كرد. براي اين كار بعد از لقاح تخمك در آزمايشگاه و بعد از رسيدن تخمك به حالت 10 سلولي، يك سلول را جدا كرده و با استفاده از پرايمرها از ژن مورد نظر PCR صورت مي‌گيرد. اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تكثير پيدا كرد، اين مفهوم هموزيگوت بودن سلول‌هاي جنيني و سالم بودن آن‌ها است.

‌تشخيـص عامل يك بيماري ناشناخته: ‌فرض كنيد بيمار شما به يك بيماري  نا‌شناخته گرفتار است و شما احتمال مي دهيد كه عامل بيماري ويروس  است. اين ويروس را نمي شود در آزمايشگاه كشت داد بنابراين با روش  PCRمي توان احتمال اين ويروس را در عرض 1 ساعت  كنترل  كرد. يعني نمونه اي از بدن بيمار و همچنين قطعه‌اي از ژن اين ويروس   را كه پرايمر نام دارد  به دستگاه مي دهيم. اگر حتي فقط 1 عدد از اين ويروس در نمونه بيمار باشد دستگاه از ژن آن ميليارد ها كپي تهيه مي كند. سپس مي توان اين حجم زياد ژن را در صفحه فيلم فلورسنت حاصل از الكتروفروز مشاهده كرد. اگر باند هاي  DNAروي ژن ديده شد مطمئن مي شويد كه بيمار ناقل اين ويروس است.

‌تعيين جنسيت جنين:  به طور معمول چند تخمك با چند اسپرم در آزمايشگاه لقاح مي‌يابند و سپس اجازه تكثير به سلول تخم داده و با رسيدن تخم به مرحله ده سلولي، يكي از سلول‌ها را جدا كرده و به وسيله پرايمرهاي ويژه مربوط به كروموزوم y مورد PCR قرار مي‌گيرد. كروموزوم y منحصرا در سلول‌هاي نر ديده مي‌شود. اگر قطعه توليد نشده در PCR به وسيله الكتروفورز و به طور دقيق‌تر توسط ساترن بلوتينگ تشخيص داده شد، جنين از نوع پسر و در غير اين صورت داراي كروموزوم‌هاي xx خواهد بود. 

تشخيص بيماري ها  كشت ميكروب ها كه جهت تشخيص بيماري‌هاي عفوني در بيشتر آزمايشگاه ها به كار مي‌رود زمان ‌بر بوده و همچنين باعث افزايش تعداد ميكروب ‌هاي بيماري زا و غير‌بيماري‌زا در شرايط آزمايشگاهي مي شود. امروزه در برخي آزمايشگاه ها روش PCR جايگزين روش‌هاي كشت شده است. يعني قطعه ‌اي از ژن مربوط به ميكروب بيماري زا مورد شناسايي قرار گرفته و پرايمرهاي مربوط توليد مي ‌شوند. با استفاده از اين پرايمرها مي ‌توان تشخيص داد كه آيا  مثلا ويروس ايدز در داخل بدن وجود دارد يا نه؟ 
از ديگر موارد استفاده از PCR مي توان، مطالعه نسبت خويشاوندي در تفحص شهدا، تشخيص بيماري هاي ژنتيكي در اثر ازدواج هاي فاميلي، تعيين هويت، تعيين سن و قد، جـرم شنـاسـي از طـريـق آثار باقيمانده از قاتل، تكثير ژن براي ايجاد آنزيم، تشخيص سرطان‌ها و ايجاد جهش هاي هدف دار را نام برد.

 

عمل پرايمر ها:

1- محل ژني كه بايد تكثير شود را مشخص مي كند.2- اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كند.

در مورد عمل دوم، زماني كه اين دو شناساگر به دو ناحيه مختلف DNA و به سمت هم قرار مي گيرند، DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانند سازي مي كند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده، تعيين مي گردد.

براي انجام PCR ‌ ، DNA الگو، پرايمر ها و نوكلئوتيد تري فسفات ها و DNA پليمراز در يك لوله با هم مخلوط مي شوند. سپس لوله را گرم مي كنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد مي كنند تا پرايمر ها به نواحي مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازي از روي DNA بنمايد. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی‌ DNA ‌ ، دوباره سيستم گرم می شود تا دوباره رشته ها از هم جدا شوند. چون در مرحله قبل DNA در ناحيه مورد نظر، مضاعف شده است، در اين مرحله 4رشته الگو برای همانند سازی وجود دارد . در پايان اين مرحله 4 نسخه از ژن مورد نظر حاصل می شود. در مرحله ‌بعدی گرم شدن سيستم 8 و بعد 16 و به همين صورت به طور تصاعدی‌تعداد نسخه های ژن ها زياد می شود. به طور كلی ‌پس از n تكرار، ما در محلول ⁿ2 نسخه از ژن مورد نظر خواهيم داشت. در ابتدای طراحی PCR ‌ از آنزيم های‌ DNA ‌ پلي مراز E.coli استفاده می شد ولی اين آنزيم به حرارت، حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار افزايش دمای محيط واكنش تا ^ْC 94، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. پس از مدتی ‌كشف شد كه باكتري ها ی چشمه های آب گرم دارای DNA پلي مراز هایي هستند كه نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای‌بالا حلاليت بهتری دارند. بنا براين  اين گونه آنزيم ها باعث شد كه به راحتی PCR به صورت اتوماتيك انجام شود و با افزودن يك بار آنزيم، ديگر نيازی به اضافه كردن مجدد آن نباشد.

در تشخیص بیماری های دامی و انسانی تکنیک های بی شماری وجود دارد . در روش مولکولی به دنبال ژنوم عامل بیماری هستیم . در روش سرولوژی آنتی بادی را با آنتی ژن ردیابی می کنیم.

نحوه قرار گرفتن بازهای آلی پیام وراثتی را تشکیل می دهد و مولکول DNA را طولانی مدت حتی در فسیل ها می توانیم ردیابی کنیم.
اما در مورد RNA این موضوع صدق نمی کند که علت آن نوع ساختمان RNA می باشد.
1- پیوند بین بازهای آلی در RNA دوگانه و و در DNA سه گانه می باشد  
2- RNA جز در موارد استثنائی معمولا تک رشته ای و DNA دورشته ای می باشد.

در دو رشته ای بازهای مکمل روبروی هم قرار می گیرند .آدنین با تیمین و گوانین با سیتوزین، RNA تیمین ندارد و اوراسیل با آدنین مقابل هم قرار می گیرند.

 

فرض می کنیم نمونه سواپ شکاف کامی حلقی سواپ نای جهت شناسائی مایکوپلاسما را به آزمایشگاه ارجاع داده اند.
انکوباسیون 4 تا 5 ساعت در دمای 37 درجه برای نمونه انجام می گیرد تا تکثیر اولیه صورت پذیرد.ابتدا یک سانترفوژ اولیه از نمونه صورت می پذیرد و ذرات ته نشین شده و مایع سطح را برداشت می کنیم، میتوان فیلتر سرسرنگی نیز انجام دهیم تا تنها مایکوپلاسما عبور کند . .
چون داخل سواپ سلول های موکوس و اپی تلیال است که با لایزر بافر باید حل شود تا سلول را لیز کند.در ابتدا در بن ماری تا 3 ساعت به دمای 56 درجه می گذاریم تا تمام سلول ها شکسته شود

دستگاه باید از ۹۴ خودش را به ۵۶ درجه برساند دستگاه های جدید در ۲ ثانیه اینکار را انجام دهد و روی کیفیت و زمان تاثیر مثبت دارد. پس از ۷  دقیقه باید به مدت ۳۰ دقیقه در دمای۵۶ درجه بماند سپس به مدت ۱ دقیقه در ۷۲ درجه تا با فرایند اکستندبا کمک آنزیم پلیمراز اسیدهای نوکلئوتید را بسازد.هر سیکل ۳ قسمت دارد و ۳۰ سیکل داریم یعنی تا ۳۰ سیکل به دستگاه برنامه می دهیم.

در مرحله اول در اثر گرمای 95 درجه دو نسخه  DNA از هم جدا می شوند در مرحله دوم پرایمر می چسبد و مرحله سوم ساخت زنجیره است.

هرچه پرایمر بزرگتر باشد اختصاصی تر است و هرچه کوچکتر باشد ویژگی آن کم می شود و هرچه میزان اسیدآمینه G و C بیشتر باشد دمای آنلینگ بالاتر می رود و خوب نیست و اختیار از کارشناس سلب می شود. 

 

مواد لازم  PCR

1. بافر  PCR: شرايط يوني ph مناسب را براي واكنش PCR فراهم مي كند. بافر به صورت x10 ساخته مي شود. اين بافر داراي گليسيرول براي سنگيني كار و داراي رنگ براي مشهود سازي DNA است.

2. دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات: كه به صورت مخلوطي از چهار باز در بازار وجوددارد تا كنار هم چيده شوند و رشته مكمل را ايجاد كنند . 

3. آغازگرها primer : پرايمرها قطعات سنتز شده اي از بازهاي آلي اند كه بر اساس قطعه مورد نظر الگوهاي هدف ساخته مي شوند كه معمولا با طول 3015 نوكلئوتيد هستند كه به DNA الگو متصل مي شوند. طول پرايمرها بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند. 
پرايمرها دو عمل انجام مي دهند. اول اين كه محل ژني  را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. بايد توجه داشت دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. پرايمر مورد نظر توسط كامپيوتر انتخاب مي شود. 
4.  Tag DNA polymerase: يك آنزيم مقاوم به دما است كه همانند سازي DNA را انجام مي‌دهد. آنزيم Tag پليمراز باعث مي شود به راحتي واكنش  PCR به طور اتوماتيك انجام شود  .

5.  2Mgclكلريد منيزيم نقش كوفاكتوري در فعاليت آنزيم Tag دارد. اثر متقابل رشته DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزايـش مـي دهـد. غلظـت كلـريـدمنيـزيـم اثـر زيـادي بـرروي اختصاصي شدن و  در نهايت بازده واكنش PCR دارد. غلظت زياد آن اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم تگ DNA پلي مراز دارد و مقدار محصول نهايي را كاهش مي دهد. 

 
6. دي ان آ الگو Template  DNA : بسته به هدف آزمايش از منابع مورد نياز با استفاده از يكي از روش هاي مرسوم استخراج مي شود. معمولا به ازاي هر واكنش 5% واحد يا 1% ميكرو ليتر استفاده مي شود . 

7. لوله هاي واكنش : لوله هاي كوچك 5% ميلي ليتر

8. سمپلر و سر سمپلرهاي يكبار مصرف مخصوص آن ها كه براي برداشتن مقادير بسيار كم استفاده مي شود. 
9. دستگاه چرخش حرارتي
10. ميكرو فيوژ

11. روغن معدني  mineral oil: يك قطره روي مخلوط واكنش اضافه مي شود تا از تبخير نمونه در دستگاه چرخش حرارتي  thermal  cycler جلوگيري مي شود. معمولا 50 تا 60 ميكروليتر به محلول واكنش 100 ميكروليتري اضافه مي شود . 

مشكل PCR و راه حل آن  اشكال PCR ، آلودگي نمونه‌هاي مورد بررسي توسط قطعات DNA خارجي است. اگر قبلا در داخل دستگاهي PCR يك نمونه انجام گرفته باشد، و ذره كوچكي از آن در داخل دستگاه باقي بماند در PCR نمونه بعدي مشكل ايجاد خواهد كرد. براي رفع مشكل، امروزه از ظروف يك بار مصرف استفاده مي‌شود. كليه ظروف قبل از استفاده اتوكلاو مي‌شوند تا سلول‌ها و مولكول هاي موجود در آن ها، تا حد ممكن غير فعال مي‌شوند.
يـكــي از روش‌هــاي پـيـشـنهـادي انجـام PCR داخـلــي يـا Nested PCR اسـت. از ايـن روش بـا استفـاده از دو پرايمر قطعه‌اي از DNA را تكثير مــي‌دهـنــد و سـپــس قـطـعــه‌اي ديـگــر در داخـل DNAهــاي تـكـثـيــر شــده PCR مــي‌شــود. بــديــن صورت احتمال آلودگي كاهش مي‌يابد.

Pcr-troubelshooting:  1)ناکافی بودنdntp    2(غلظت پرایمر    3)غلظتtaqپلیمراز

4)غلضتMg ,Kcl

RT_PCR

اين روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن ‏RNA‏ است. اولين مرحله در اين روش تبديل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏DNAاي كه مكمل توايس‌هاي ‏mRNA‏ است) توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس صورت مي‌گيرد (‏RT‏). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضي از ويروس‌ها مانند ويروس هپاتيت ‏B‏ هرگز به شكل ‏DNA‏ مابين  در اثر آنزيم نسخه‌بردار معكوس درنمي‌آيد. آنزيم نسخه‌بردار معكوس (‏RT‏) در اين روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.
كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك ‏DNA‏ پليمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود يافت كه در حضور يون ‏Mn+2‎‏ داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته مي‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (‏EGTA‏) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از ‏DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.‏

ARMS-PCR
‏ اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است. اين روش نام‌هاي ديگري نيز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

Nasted-PCR

در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود، طوري كه جفت دوم در بني جفت اول جاي مي‌گيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير مي‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف كوچكتري از ‏DNA‏ كه درون ‏PCR‏ اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير مي‌شود.‏
مزاياي اين روش تغيير يافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نياز به پروب (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است، 2) حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است و 3) به دليل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بيماري‌هاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.‏
همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه مي‌تواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكان‌پذير است. جنين‌هاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.

Real-time-PCR
‏ به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را مي‌دهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از كاوشگرها يا پروب‌هاي هيبريداسيون نشان‌دار شده با رنگ‌هاي فلورسانس در انتهاي 5 يا 3 استفاده مي‌شود. كه امكان پايش پيوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازي آنها در روش‌هاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد مي‌دهد. اين سيستم در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلك‌هاي ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روش‌هاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم ‏PCR‏ معمولي شده است. سازندگان و كاربران اين روش سعي مي‌كنند محصول ‏PCR‏ كوچك‌تر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهينه نمي‌كند. البته اين روش داراي معايبي نيز است از جمله مي‌توان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرم‌ها با شيمي برخي رنگ‌هاي فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروس‌هاي عامل بيماري‌هاي انسان از اين روش استفاده شده است

 

منابع :
[1]بـيـوتـكـنـولوژي مولكولي اصول و كاربرد  DNAنوتركيب (جلد اول)،برنارد آر كيلك، جك جياسترنگ،دكتر جواد بهروان،1382

[2]كلون سازي ژن ها و آناليز DNA ، مجتبي طباطبايي يزدي، 1387 

[3]Dr Margaret Hunt, University of South Carolina, 2006, Real Time PCR

[4]Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, January 2009, REA-TIME PCR Current Technology and Applications

[5]Guven.S,Yilmaz. E,kutby.H and eta. The Diagnostic Value of Polymerase chain Reaction (PCR) in Bronchialveolveolar Lavage. Eastern Journal of Medicine 9(1): 07-12, 2004
[6]http://www.mums.ac.ir

[7]http://www.horizonpress.com
http://www.howstuffworks.com

Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (82003). A Short History of the Polymerase Chain Reaction.

Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (91988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 (4839): 487–491.

  gournal of clinical mcrobioloy American society(10  

11 www.fermentas.com

  Erlish.h.a.pcr trchnokogy principles and application(12 4

133 )www.mvg-biotech.com

www.elesivier.com (14

  15)www.horizonpress.com                 16)www.info.med.yale.edu/genetics  

تهیه وتنظیم: www.microorganism.blogfa.com                        [e-mail]

 Microdeletion screening

One application of multiplex PCR is microdeletion screening. This can be applied to the X and Y chromosomes (male genomic DNA) or to hybrid cell lines (rodent-human) containing one copy only of a human chromosome of interest. Figures below show a few examples of multiplex PCR screening reactions for microdeletions on human chromosome Y. Fig. 43 shows microdeletion screening reactions with multiplex mixtures A and B Fig. 44 shows microdeletion screening reactions with mixture D (gel separation in 4 hours at high voltage) Fig. 45 shows microdeletion screening reactions with mixture D but in conditions in which gel separation was performed overnight (16 hours) at low voltage. PCR products are visible but more diffused. See also page 15.
Fig. 43. Y-chromosome microdeletion screening reactions of 12 male genomic DNA samples (yellow) using multiplex mixture B (5 loci) and of 11 DNA samples (green) using multiplex mixture A (7 loci). DNA samples 1, 2, 9, 10 and 12 (yellow) and 1 and 2 (green) show deletion of some loci tested (lack of amplification products).
	Fig. 44. Y-chromosome microdeletion screening reactions of 16 male genomic DNA samples (yellow) using multiplex mixture D (5 loci). DNA samples 10, 11, 12, and 13 show deletion of some loci tested. Gel separation was done at high voltage, in about 3-4 hours. See also Fig. 45 for comparisons.
	Fig. 45. Y chromosome deletion screening using esentially the same DNA samples and primer mixture D as in Fig. 44 above. Only the order of the samples on the gel was somewhat changed. Gel separation was done overnigtht (16 hours) at low voltage. Products appear much more diffuse but result interpretation can be easily done.

 

Standard multiplex mixtures

Over 75 primer pairs were chosen and a number of multiplex mixtures were designed and used for different purposes. Examples of all multiplex mixes are presented below. (All unlabeled gel lanes are the marker: 1 kb DNA ladder (GIBCO). At the bottom of each image, the PCR buffer concentration used is also indicated)
	Fig. 1. Mixtures A-E on an a 2.5% agarose gel. Arrow indicates the presence of an unspecific product. Although not desirable, this product did not interfere with the use of mix E in a microdeletion screening project. Occasionally, mix C was used without the primers for loci 4 and 5. In such cases, this mix is called mix C*.
	Fig. 2. Mixtures F-I on a 2.5% agarose gel.

Fig. 3. Multiplex PCR with mix J on four different genomic DNA templates, separated on an a denaturing, 6% polyacrylamide gel. Primers amplify nonpolymorphic loci. The sizes of the longest and the shortest product are also indicated.

Fig. 4. Multiplex PCR with mix K on eight different genomic DNA templates, separated on an a denaturing, 6% polyacrylamide gel. These primers amplify polymorphic loci, and alleles of different sizes can be observed. The shortest alleles of locus 6 and the longest alleles of locus 7 can, sometimes, overlap, making it difficult to assign precisely their origin. The sizes of the longest and the shortest product are also indicated.

 

PCR and multiplex PCR guide

---

Table below lists the parameters influencing the PCR reaction and indicates some PCR and multiplex PCR applications. Clicking on an item in the table, will take you to a detailed page, describing that particular issue.

Topics for PCR optimization
0.Standards: examples of multiplex reactions used in all experiments
1	Generalities Components, PCR cycle, vials	9	Annealing time and temperature
2	Choosing PCR primers How to design the primers	10	Extension time and temperature
3	Reaction volumes Do they influence the results?	11	DNA template concentration
4	Number of PCR products Multiplexing. How ?	12	Taq polymerase(s) Comparisons and concentration
5	Primer amount How much primer?	13	dNTP concentration Interaction with magnesium
6	PCR buffers Comparisons and concentration	14	MgCl2 concentration Interaction with dNTP and salt (PCR buffer)
7	Salt (KCl) concentration Essential optimization factor	15	Gel electrophoresis Agarose and polyacrylamide (PAA)
8	Designing PCR programs Customize them for your purpose	16	Adjuvants in PCR DMSO, glycerol and BSA
Some applications of PCR and multiplex PCR
A	Microdeletion screening	D	PCR labeling
B	LOH	E	InterAlu-PCR
C	Quantitative multiplex PCR*	F	Degenerative priming PCR

 

 

Troubleshooting for PCR

Troubleshooting for PCR and multiplex PCR

---

Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles.

COMPONENT	VOLUME	FINAL CONCENTRATION
1.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0)	20.7µL	-
2.10x PCR Buffer*	2.5µL	1x
3.dNTPs mix (25 mM each nucleotide)	0.2µL	200 µM (each nucleotide)
4.primer mix (25 pmoles/µL each primer)	0.4µL	0.4 µM (each primer)
5.Taq DNA polymerase (native enzyme)	0.2µL	1 Unit/25 µL
6.genomic DNA template (100 ng/µL)	1.0µL	100 ng/25 µL

* The 10x PCR buffer contains: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl2 (the final concentrations of these ingredients in the PCR mix are: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2).

---

QUESTIONS	SOLUTIONS
1. I get (many) longer unspecific products. What can I do?	Decrease annealing time Increase annealing temperature Decrease extension time Decrease extension temperature to 62-68º C Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM. Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Take less primer Take less DNA template Take less Taq polymerase If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s) Combine some/all of the above
2. I get (many) shorter unspecific products. What can I do?	Increase annealing temperature Increase annealing time Increase extension time Increase extension temperature to 74-78º C Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant Take less primer Take less DNA template Take less Taq polymerase If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s) Combine some/all of the above
3. Reaction was working before, but now I can't get any product.	Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, template, Taq, etc) Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR) If you just bought new primers, check for their reliability (bad primer synthesis ?) Increase primer amount Increase template amount Decrease annealing temperature by 6-10º C and check if you get any product. If you don't, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones) reaction conditions as described above. Combine some/all of the above
4. My PCR product is weak. Is there a way to increase the yield?	Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible. Increase the amount of PCR primer Increase the amount of DNA template Increase the amount of Taq polymerase Change buffer (KCl) concentration (higher if product is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp) Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol. Check primer sequences for mismatches and/or increase the primer length by 5 nucleotides Combine some/all of the above
5. My two primers have very different melting temperatures (Tm) but I cannot change their locus. What can I do to improve PCR amplification?	An easy solution is to increase the length of the primer with low Tm. If you need to keep the size of the product constant, add a few bases at the 3' end. If size is not a concern, add a few bases at either the 3' or the 5' end of that primer.
6. I have a number of primer pairs I would like to use together. Can I run a multiplex PCR with them?. How?	Very likely, yes. Try amplify all loci seaprately using the same PCR program. If one of the primer pairs yields unspecific products, keep the cycling conditions constant and change other parameters as mentioned above (#1 and #2). Mix equimolar amounts of primers and run the multiplex reaction either in the same cycling conditions or by decreasing only the annealing temperature by 4º C. If some of the loci are weak or not amplified, read below !!
7. How many loci can I amplify in multiplex PCR at the same time?	Difficult to say. The author has routinely amplified from 2 to 14 loci. Literature describes up to 25 loci or so.
8. One or a few loci in my multiplex reaction are very weak or invisible. How can amplify them?	The first choice should be increasing the amount of primer for the "weak" loci at the same time with decreasing the amount of primer for all loci that can be amplified. The balance between these amounts is more important than the absolute values used !!. Check primer sequences for primer-primer interactions
9. Short PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield?	Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Decrease denaturing time Decrease annealing time and temperature Decrease extension time and temperature Increase amount of primers for the "weak" loci while decreasing the amount for the "strong" loci. Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above
10. Longer PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield?	Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Increase denaturing time Increase annealing time Decrease annealing temperature Increase extension time and temperature Increase amount of primers for the "weak" loci while decreasing the amount for the "strong" loci Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above
11. All products in my multiplex reaction are weak. How can I improve the yield?	Decrease annealing temperature in small steps (2º C) Decrease extension temperature to 62-68º C Increase extension time Increase template concentration Increase overall primer concentration Adjust Taq polymerase concentration Change KCl (buffer) concentration, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above
12. Unspecific products appear in my multiplex reaction. Can I get rid of them somehow?	If long: increase buffer concentration to 1.2-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM If short: decrease buffer concentration to 0.7-0.9x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Gradually increase the annealing temperature Decrease amount of template Decrease amount of primer Decrease amount of enzyme Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol If nothing works: run PCR reactions for each (multiplexed) locus individually, using an annealing temperature lower than usual. Compare the unspecific products for each locus tested with the unspecific products seen when running the multiplex PCR. This may indicate which primer pair yields the unspecific products in the multiplex reaction. Combine some/all of the above (Note: primer-primer interactions in multiplex PCR are usually translated into lack of some amplification products rather than the appearance of unspecific products)