PCRخیلی کلی(خواهشم جهت استفاده نام منبع سایت ذکر شود.ممنون)
IN THE NAME OF GOD
PCR (the polymeras chain reaction)
اين تكنيك در اواسط دهه 1980 به وسيله كری مو ليس Kary mullis معرفیشد. PCR روشی برای تكثير يك توالی خاص در DNA است. ديگر لازم نيست برای به دست آوردن نسخه های متعدد از يك ژن خاص، آن را وارد حامل مناسب كرده و در يك باكتری، تكثير كنند و امروزه اين كار به سادگی و با استفاده از PCR انجام می پذيرد. يعنی PCRهم چون ايجاد كلونی در مهندسی ژنتيك نوعی ازدياد مولكولیاست كه در اثر آن تعداد زيادی نسخه از منطقه ای خاص از DNA هدف حاصل میشود. PCR از نظر اصول علمیتشابه زيادی به همانند سازی DNA دارد؛ در واقع بر گرفته از آن است. با حرارت دادن می توان دو رشته DNA را از هم جدا كرد و با سرد كردن مي توان دوباره دو رشته DNA را با هم جفت كرد. از اين ويژگي DNA در تكنيك PCR استفاده مي شود. بعلاوه براي انجام PCR به DNA پليمراز، نوكلئوتيد تري فسفات ها و پرايمر نياز است. اما از آنجايي كه DNA دو رشته اي است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است.3مرحله این تکنیک شامل:
مرحله دناتوراسيون DNA: در مرحله اول براي مدت كوتاهي (30 ثانيه) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتيگراد حرارت ميدهند تا دو زنجيره DNA از هم باز شود.
مرحله پرايمر و مرحله اتصال دو قطعه نوكلئوتيدي: اين قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلي تشكيل ميشوند و ميتوانند به قطعات مكمل خود كه بر روي ژن مورد نظر قرار ميگيرند، اتصال يابند. قطعهاي كه در آن PCR به تعداد زياد ساخته ميشود مرحله اتصال پرايمرها كوتاه بوده و در حدود 30 ثانيه در دماي 65 - 30 درجه سانتيگراد صورت ميگيرد.
مرحله پليمريزاسيون يا مرحله سنتز: در اين مـرحلـه، با دخالت آنزيم DNA پليمراز بر روي رشـتــه DNA الـگــو و سـنـتــز DNA بــا اسـتـفـاده از نـوكـلـئـوتـيـد تـري فـسـفـاتهـايي كه در محلول وجود دارند، صورت ميگيرد و براي سنتز DNA هـميشه يك رشته DNA به صورت الگو و يك قطعه پلي نوكلئوتيدي به عنوان پرايمر مورد نياز است.
ادامه PCR بعد از چرخه اول
بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام ميشود و چـرخـه هاي بعدي تكرار چرخه اول است.
بدين صورت به دنبال چرخههاي متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي افزايش مييابد.
يعني از 20 چرخه ، ژن مورد نظر داراي بـــيــــــش از 1مـــيـــلـــيـــــون
خـــــواهـــــد بـــــود . بنابراين روش PCR روشي كارا در ازدياد يك قطعه از DNA
است.
مهمترین کاربردهای pcr: 1(مهندسی ژنتیک 2)بیولوژی مولکولی 3)میکروب شناسی تشخیصی
4)تشخیص سرطانها وجهشها 5)بیماریهای ژنتیکی 6)تشخیص هویت 7)جرم شناسی
8)تعیین ترادف 9)باستان شناسی 10)مطالعه تکاملی موجودات 11)تعیین جنسیت
12)تهیه نسخه های متعدد از یک ژن 13)برسی حضورر یا عدم حضور یک ژن در DNA
13)پیوستگی ژنها وکراسینگ اوور 14)بیوتکنولوژی 15)تعیین جنسیت
كاربردهاي مهم pcr:
تهيـه نسخههاي متعدد از يك ژن مورد نظـر: گاهي براي مطالعات بيولوژي مولكولي لازم است كه يك ژن با نسخههاي نسبتا زياد در دسترس باشد. بدين منظور ميتوان با استفاده از روش PCR، ژن مورد نظر را در مقايسه با بقيه ژنها تكثير كرد.
بررسي حضور يا عدم حضور يك ژن: با استفاده از اين روش ميتوان تشخيص داد كه آيا يك ژن در يك سلول حضور دارد يا نه؟ گاهي نيز از اين مطالعات براي بررسي وجود ژنهاي مختلف باكتريها يا ويروسها در بدن افراد استفاده ميكنند.
تشخيص بيماريهاي قبل از تولد: با استفاده از PCR و به كار گرفتن پرايمرهاي مربوط به يك ژن بيمار و پرايمرهاي مربوط به ژن سالم آن، ميتوان از تولد كودكان داراي بيماريهاي ژنتيكي جلوگيري كرد. براي اين كار بعد از لقاح تخمك در آزمايشگاه و بعد از رسيدن تخمك به حالت 10 سلولي، يك سلول را جدا كرده و با استفاده از پرايمرها از ژن مورد نظر PCR صورت ميگيرد. اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تكثير پيدا كرد، اين مفهوم هموزيگوت بودن سلولهاي جنيني و سالم بودن آنها است.
تشخيـص عامل يك بيماري ناشناخته: فرض كنيد بيمار شما به يك بيماري ناشناخته گرفتار است و شما احتمال مي دهيد كه عامل بيماري ويروس است. اين ويروس را نمي شود در آزمايشگاه كشت داد بنابراين با روش PCRمي توان احتمال اين ويروس را در عرض 1 ساعت كنترل كرد. يعني نمونه اي از بدن بيمار و همچنين قطعهاي از ژن اين ويروس را كه پرايمر نام دارد به دستگاه مي دهيم. اگر حتي فقط 1 عدد از اين ويروس در نمونه بيمار باشد دستگاه از ژن آن ميليارد ها كپي تهيه مي كند. سپس مي توان اين حجم زياد ژن را در صفحه فيلم فلورسنت حاصل از الكتروفروز مشاهده كرد. اگر باند هاي DNAروي ژن ديده شد مطمئن مي شويد كه بيمار ناقل اين ويروس است.
تعيين جنسيت جنين: به طور معمول چند تخمك با چند اسپرم در آزمايشگاه لقاح مييابند و سپس اجازه تكثير به سلول تخم داده و با رسيدن تخم به مرحله ده سلولي، يكي از سلولها را جدا كرده و به وسيله پرايمرهاي ويژه مربوط به كروموزوم y مورد PCR قرار ميگيرد. كروموزوم y منحصرا در سلولهاي نر ديده ميشود. اگر قطعه توليد نشده در PCR به وسيله الكتروفورز و به طور دقيقتر توسط ساترن بلوتينگ تشخيص داده شد، جنين از نوع پسر و در غير اين صورت داراي كروموزومهاي xx خواهد بود.
تشخيص بيماري ها كشت ميكروب
ها كه جهت تشخيص بيماريهاي عفوني در بيشتر آزمايشگاه ها به كار ميرود زمان بر
بوده و همچنين باعث افزايش تعداد ميكروب هاي بيماري زا و غيربيماريزا در شرايط
آزمايشگاهي مي شود. امروزه در برخي آزمايشگاه ها روش PCR جايگزين روشهاي كشت شده
است. يعني قطعه اي از ژن مربوط به ميكروب بيماري زا مورد شناسايي قرار گرفته و
پرايمرهاي مربوط توليد مي شوند. با استفاده از اين پرايمرها مي توان تشخيص داد
كه آيا مثلا ويروس ايدز در داخل بدن وجود دارد يا نه؟
از ديگر موارد استفاده از PCR مي توان، مطالعه نسبت خويشاوندي در تفحص شهدا، تشخيص
بيماري هاي ژنتيكي در اثر ازدواج هاي فاميلي، تعيين هويت، تعيين سن و قد، جـرم شنـاسـي
از طـريـق آثار باقيمانده از قاتل، تكثير ژن براي ايجاد آنزيم، تشخيص سرطانها و
ايجاد جهش هاي هدف دار را نام برد.
عمل پرايمر ها:
1- محل ژني كه بايد تكثير شود را مشخص مي كند.2- اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كند.
در مورد عمل دوم، زماني كه اين دو شناساگر به دو ناحيه مختلف DNA و به سمت هم قرار مي گيرند، DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانند سازي مي كند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده، تعيين مي گردد.
براي انجام PCR ، DNA الگو، پرايمر ها و نوكلئوتيد تري فسفات ها و DNA پليمراز در يك لوله با هم مخلوط مي شوند. سپس لوله را گرم مي كنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد مي كنند تا پرايمر ها به نواحي مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازي از روي DNA بنمايد. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی DNA ، دوباره سيستم گرم می شود تا دوباره رشته ها از هم جدا شوند. چون در مرحله قبل DNA در ناحيه مورد نظر، مضاعف شده است، در اين مرحله 4رشته الگو برای همانند سازی وجود دارد . در پايان اين مرحله 4 نسخه از ژن مورد نظر حاصل می شود. در مرحله بعدی گرم شدن سيستم 8 و بعد 16 و به همين صورت به طور تصاعدیتعداد نسخه های ژن ها زياد می شود. به طور كلی پس از n تكرار، ما در محلول n2 نسخه از ژن مورد نظر خواهيم داشت. در ابتدای طراحی PCR از آنزيم های DNA پلي مراز E.coli استفاده می شد ولی اين آنزيم به حرارت، حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار افزايش دمای محيط واكنش تا ْC 94، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. پس از مدتی كشف شد كه باكتري ها ی چشمه های آب گرم دارای DNA پلي مراز هایي هستند كه نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمایبالا حلاليت بهتری دارند. بنا براين اين گونه آنزيم ها باعث شد كه به راحتی PCR به صورت اتوماتيك انجام شود و با افزودن يك بار آنزيم، ديگر نيازی به اضافه كردن مجدد آن نباشد.
در تشخیص بیماری های دامی و انسانی تکنیک های بی شماری وجود دارد . در روش مولکولی به دنبال ژنوم عامل بیماری هستیم . در روش سرولوژی آنتی بادی را با آنتی ژن ردیابی می کنیم.
نحوه قرار گرفتن بازهای آلی پیام وراثتی را تشکیل می دهد و مولکول
DNA را طولانی مدت حتی در فسیل ها می توانیم ردیابی کنیم.
اما در مورد RNA این موضوع صدق نمی کند که علت آن نوع ساختمان RNA می باشد.
1- پیوند بین بازهای آلی در RNA دوگانه و و در DNA سه گانه می باشد
2- RNA جز در موارد استثنائی معمولا تک رشته ای و DNA دورشته ای می باشد.
در دو رشته ای بازهای مکمل روبروی هم قرار می گیرند .آدنین با تیمین و گوانین با
سیتوزین، RNA تیمین ندارد و اوراسیل با آدنین مقابل هم قرار می گیرند.
فرض می کنیم نمونه سواپ شکاف کامی حلقی سواپ نای جهت شناسائی
مایکوپلاسما را به آزمایشگاه ارجاع داده اند.
انکوباسیون 4 تا 5 ساعت در دمای 37 درجه برای نمونه انجام می گیرد تا تکثیر اولیه
صورت پذیرد.ابتدا یک سانترفوژ اولیه از نمونه صورت می پذیرد و ذرات ته نشین شده و
مایع سطح را برداشت می کنیم، میتوان فیلتر سرسرنگی نیز انجام دهیم تا تنها
مایکوپلاسما عبور کند . .
چون داخل سواپ سلول های موکوس و اپی تلیال است که با لایزر بافر باید حل شود تا
سلول را لیز کند.در ابتدا در بن ماری تا 3 ساعت به دمای 56 درجه می گذاریم تا تمام
سلول ها شکسته شود
دستگاه باید از ۹۴ خودش را به ۵۶ درجه برساند دستگاه های جدید در ۲ ثانیه اینکار را انجام دهد و روی کیفیت و زمان تاثیر مثبت دارد. پس از ۷ دقیقه باید به مدت ۳۰ دقیقه در دمای۵۶ درجه بماند سپس به مدت ۱ دقیقه در ۷۲ درجه تا با فرایند اکستندبا کمک آنزیم پلیمراز اسیدهای نوکلئوتید را بسازد.هر سیکل ۳ قسمت دارد و ۳۰ سیکل داریم یعنی تا ۳۰ سیکل به دستگاه برنامه می دهیم.
در مرحله اول در اثر گرمای 95 درجه دو نسخه DNA از هم جدا می شوند در مرحله دوم پرایمر می چسبد و مرحله سوم ساخت زنجیره است.
هرچه پرایمر بزرگتر باشد اختصاصی تر است و هرچه کوچکتر باشد ویژگی آن کم می شود و هرچه میزان اسیدآمینه G و C بیشتر باشد دمای آنلینگ بالاتر می رود و خوب نیست و اختیار از کارشناس سلب می شود.
مواد لازم PCR
1. بافر PCR: شرايط يوني ph مناسب را براي واكنش PCR فراهم مي كند. بافر به صورت x10 ساخته مي شود. اين بافر داراي گليسيرول براي سنگيني كار و داراي رنگ براي مشهود سازي DNA است.
2. دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات: كه به صورت مخلوطي از چهار باز در بازار وجوددارد تا كنار هم چيده شوند و رشته مكمل را ايجاد كنند .
3. آغازگرها primer : پرايمرها
قطعات سنتز شده اي از بازهاي آلي اند كه بر اساس قطعه مورد نظر الگوهاي هدف ساخته
مي شوند كه معمولا با طول 3015 نوكلئوتيد هستند كه به DNA الگو متصل مي شوند. طول
پرايمرها بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي
كند.
پرايمرها دو عمل انجام مي دهند. اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود
مشخص ميكنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. بايد توجه
داشت دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. پرايمر مورد نظر توسط كامپيوتر
انتخاب مي شود.
4.
Tag DNA polymerase: يك آنزيم مقاوم به دما است كه همانند سازي DNA را انجام
ميدهد. آنزيم Tag پليمراز باعث مي شود به راحتي واكنش PCR به طور اتوماتيك
انجام شود .
5.
2Mgclكلريد منيزيم نقش كوفاكتوري در فعاليت آنزيم Tag دارد. اثر متقابل رشته
DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزايـش مـي دهـد. غلظـت كلـريـدمنيـزيـم اثـر زيـادي
بـرروي اختصاصي شدن و در نهايت بازده واكنش PCR دارد. غلظت زياد آن اثر
بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم تگ DNA پلي مراز دارد و مقدار محصول نهايي را كاهش
مي دهد.
6.
دي ان آ الگو Template DNA : بسته به هدف آزمايش از منابع مورد نياز با
استفاده از يكي از روش هاي مرسوم استخراج مي شود. معمولا به ازاي هر واكنش 5% واحد
يا 1% ميكرو ليتر استفاده مي شود .
7.
لوله هاي واكنش
: لوله هاي كوچك 5% ميلي ليتر
8. سمپلر و سر سمپلرهاي
يكبار
مصرف
مخصوص آن ها كه براي برداشتن مقادير بسيار كم استفاده مي شود.
9.
دستگاه چرخش حرارتي
10.
ميكرو فيوژ
11. روغن معدني mineral oil: يك قطره روي مخلوط واكنش اضافه مي شود
تا از تبخير نمونه در دستگاه چرخش حرارتي thermal cycler جلوگيري مي
شود. معمولا 50 تا 60 ميكروليتر به محلول واكنش 100 ميكروليتري اضافه مي شود
.
مشكل PCR و راه حل آن اشكال PCR
، آلودگي نمونههاي مورد بررسي توسط قطعات DNA خارجي است. اگر قبلا در داخل
دستگاهي PCR يك نمونه انجام گرفته باشد، و ذره كوچكي از آن در داخل دستگاه باقي
بماند در PCR نمونه بعدي مشكل ايجاد خواهد كرد. براي رفع مشكل، امروزه از ظروف يك
بار مصرف استفاده ميشود. كليه ظروف قبل از استفاده اتوكلاو ميشوند تا سلولها و
مولكول هاي موجود در آن ها، تا حد ممكن غير فعال ميشوند.
يـكــي از روشهــاي پـيـشـنهـادي انجـام PCR داخـلــي يـا Nested PCR اسـت. از
ايـن روش بـا استفـاده از دو پرايمر قطعهاي از DNA را تكثير مــيدهـنــد و
سـپــس قـطـعــهاي ديـگــر در داخـل DNAهــاي تـكـثـيــر شــده PCR مــيشــود.
بــديــن صورت احتمال آلودگي كاهش مييابد.
Pcr-troubelshooting: 1)ناکافی بودنdntp 2(غلظت پرایمر 3)غلظتtaqپلیمراز
4)غلضتMg ,Kcl
RT_PCR
اين روش به
PCR نسخهبرداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن RNA است. اولين
مرحله در اين روش تبديل RNA به DNA (DNAاي كه مكمل توايسهاي mRNA است)
توسط آنزيم نسخهبردار معكوس صورت ميگيرد (RT). برخي از موجودات مانند برخي از
ويروسهاي RNAدار، ژنومشان تنها از RNA ساخته شده است. بعضي از ويروسها مانند
ويروس هپاتيت B هرگز به شكل DNA مابين در اثر آنزيم نسخهبردار معكوس
درنميآيد. آنزيم نسخهبردار معكوس (RT) در اين روش از "Avian
Myeloblastosis Virus (AMV)" و "Moloney Murine Leu Kemia Virus
(MMLV) " بهدست آمد.
كاربرد اين آنزيم بهدليل آنكه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي
با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك DNA پليمر از مقاوم به نام
(Tth) بهبود يافت كه در حضور يون Mn+2 داراي فعاليت نسخهبرداري معكوس است و
در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود و سپس
Mn+2 اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (EGTA) حذف ميشود و سپس اين
آنزيم از DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير ميكند.
ARMS-PCR
اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهشهاي نقطهاي است. در اين روش از
پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده ميشود. اگر عمل
پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشاندهنده نبود جهش نقطهاي
در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام
شود، نشاندهنده حضور جهش نقطهاي در باز مورد نظر است. اين روش نامهاي ديگري نيز
دارد از جمله MAMA-PCR مخفف Amplificatin Multation Assay Mismatch و
COP-PCR مخفف Competitive Oligonucleotide Primming.
Nasted-PCR
در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده ميشود، طوري كه جفت دوم در بني جفت اول جاي
ميگيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير ميشود،
سپس محصول PCR حاصل به لولهاي ديگر منتقل ميشود و بهعنوان الگو و با استفاده
از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم PCR انجام شده و ترادف كوچكتري از DNA كه درون
PCR اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير ميشود.
مزاياي اين روش تغيير يافته PCR عبارت است از: 1) نياز به پروب (كاوشگر) و
تأييدهاي بعدي كمتر است، 2) حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است و 3) به
دليل انتقال محصول PCR دور اول به لوله جديد، ممانعت كنندهها رقيق ميشود. اين
روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق
توانستهاند بيماريهاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار
جلوگيري كنند.
همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه ميتواند سبب ناشنوايي در 1% از
كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق
امكانپذير است. جنينهاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين
روش تشخيص داده شدند.
Real-time-PCR
به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته
خاصيت فلوئورسانس محصول PCR در زمان جمع شدن را ميدهد، اين روش ابداع شد. در
اين روش از كاوشگرها يا پروبهاي هيبريداسيون نشاندار شده با رنگهاي فلورسانس در
انتهاي 5 يا 3 استفاده ميشود. كه امكان پايش پيوسته محصول PCR را بدون جداسازي
آنها در روشهاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد ميدهد. اين سيستم
در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلكهاي PCR، حذف مرحله
Post-PCR و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روشهاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث
افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم PCR معمولي شده است. سازندگان و كاربران
اين روش سعي ميكنند محصول PCR كوچكتر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما
تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده PCR را بهينه نميكند. البته
اين روش داراي معايبي نيز است از جمله ميتوان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه
محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرمها با شيمي برخي رنگهاي
فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروسهاي عامل بيماريهاي انسان از
اين روش استفاده شده است
منابع :
[1]بـيـوتـكـنـولوژي
مولكولي اصول و كاربرد DNAنوتركيب (جلد اول)،برنارد آر كيلك، جك
جياسترنگ،دكتر جواد بهروان،1382
[2]كلون سازي ژن ها و آناليز DNA ، مجتبي طباطبايي يزدي، 1387
[3]Dr Margaret Hunt, University of South Carolina, 2006, Real Time PCR
[4]Julie Logan, Kirstin
Edwards and Nick Saunders, January 2009, REA-TIME PCR Current Technology and
Applications
[5]Guven.S,Yilmaz.
E,kutby.H and eta. The Diagnostic Value of Polymerase chain Reaction (PCR) in
Bronchialveolveolar Lavage. Eastern Journal of Medicine 9(1): 07-12, 2004
[6]http://www.mums.ac.ir
[7]http://www.horizonpress.com
http://www.howstuffworks.com
Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (82003). A Short History of the Polymerase Chain Reaction.
Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (91988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 (4839): 487–491.
gournal of clinical mcrobioloy American society(10
Erlish.h.a.pcr trchnokogy principles and application(12 4
133 )www.mvg-biotech.com
www.elesivier.com (14
15)www.horizonpress.com 16)www.info.med.yale.edu/genetics
تهیه وتنظیم: www.microorganism.blogfa.com HFA60@YAHOO.COM---WWW.MICROBIOLOGHY.BLOGFA.COM